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銅綠假單胞菌混合蛋白疫苗制備研究

返回列表 來源:未知 發布日期:2019-10-18 10:33【

銅綠假單胞菌( Pseudomonas aeruginosa) 又稱綠 膿桿菌,屬于 γ-變形菌綱假單胞菌科,是一種在自然 界中廣泛存在的條件性致病菌。銅綠假單胞菌 生存能力極強,能在各種環境中存活,并在機體免疫 功能低下或受損時引發感染,可引起人體燒傷或 創傷部位的傷口感染、中耳炎、角膜炎、肺炎甚至敗血 癥; 奶牛或奶羊乳房炎; 水貂出血性肺炎; 雛雞敗血癥; 仔豬腹瀉等疾病。近年來,銅綠假單胞菌抗 生素耐藥問題日趨嚴重,因此疫苗研發再次成為國內 外學者研究的熱點。2000 年,完成了銅綠假單 胞菌 PA01 菌株基因組測序,從而為認知該物種的復 雜性提供了幫助。

1 材料

1. 1 試驗動物

清潔級 ICR 品系小白鼠 105 只,雌性,體重為 18 ~ 22 g; 清 潔 級 豚 鼠 15 只,雌 性,體 重 為 250 ~ 350 g; 均購自黑龍江省中醫藥大學實驗動物中心。

1. 2 藥品

0. 9%氯化鈉注射液,購自哈爾濱三聯藥業股份有限公司。

1. 3 主要試劑

銅綠假單胞菌內毒素蛋白、類毒素( 由外毒素 A 脫毒制備) 、外膜蛋白樣品及內毒素蛋白陽性血清、 類毒素陽性血清、外膜蛋白陽性血清和陰性血清,由 中國醫學細菌保藏管理中心銅綠假單胞菌專業實驗 室提供; PBST 緩沖液,購自上海莼試生物技術有限公 司; 牛血清白蛋白,購自鹽城賽寶生物科技有限公司; 辣根過氧化物酶標記的SPA,購自上海科匯生物技術有限公司; 鱟試劑、細菌內毒素工作標準品、細菌內毒素檢查用水,購自廈門市鱟試劑實驗廠有限公司; 硫 柳汞鈉,購自上海信裕生物科技有限公司。

1. 4 主要儀器

生物安全柜( 型號為 CLASS Ⅱ TYPE A2) ,購自北京東聯哈爾儀器制造有限公司; 電熱恒溫培養箱 ( 型號為 DNP-9082) ,購自上海精宏實驗設備有限公 司; 獨立送風隔離籠具( 型號為 IVC-II) ,購自蘇州馮 氏實驗動物設備有限公司; 多功能酶標儀( 型號為 Infinite M200 PRO) ,購自瑞士 Tecan 公司。

2 方法

2. 1 內毒素蛋白、類毒素和外膜蛋白抗體效價的檢測

取銅綠假單胞菌內毒素蛋白、類毒素和外膜蛋 白,在百級潔凈條件下以 0. 9%氯化鈉注射液分別制 備成 0. 4 mg /mL 的溶液,加入終濃度為 0. 01%的硫 柳汞鈉,混合均勻后用 0. 22 μm 濾器過濾,分裝成針 劑,4. 3 mL /安瓿。 取 32 只小白鼠,將其分成 4 組,每組 8 只,其中 3 組分別用上述 3 種蛋白針劑腹部皮下免疫小鼠,首 免 0. 1 mL,二免 0. 2 mL,三免 0. 3 mL,每次間隔 3 d。 剩余 1 組為 0. 9%氯化鈉注射液對照組,免疫時間及 劑量與另 3 組相同。 免疫前小鼠斷尾采血,首免后每間隔 7 d 采血, 共采血 7 次,4 ℃、4 000 r /min 離心 10 min 收集血 清。間接 ELISA 法測定血清抗體水平,參照殷州 的方法。1) 包被抗原 100 μL /孔,4 ℃ 過夜后棄去孔 內液體,用 pH 值 7. 4 PBST 洗滌 2 次,每次 5 min,在 濾紙上拍干; 0. 5% BSA 200 μL /孔封閉,37 ℃ 作用 1. 5 h; 用 pH 值為 7. 4 的 PBST 洗滌 3 次,每次 5 min, 在濾紙上拍干; 加血清 100 μL /孔,37 ℃ 作用 1 h,每 孔做 3 個重復,洗滌 3 次; 加辣根過氧化物酶標記的 SPA( 用 PBST 稀釋) 100 μL /孔,37 ℃ 作用 1 h,洗滌 4 次。2) 加底物溶液 100 μL /孔,37 ℃ 反應 15 min; 加 2 mol /L 硫酸 100 μL /孔; 在 450 nm 波長處測定每 孔 OD 值。 按上述步驟建立的間接 ELISA 方法,對對照組 的8 份陰性血清進行檢測,每份樣品重復 3 孔,結果 取平均值,計算樣品 OD450值,數據用“平均值±標準 差”表示。

2. 2 內毒素蛋白、類毒素和外膜蛋白內毒素含量的測定

按照《中華人民共和國藥典》( 2015 年版) 中規 定的方法進行試驗。

2. 2. 1 細菌內毒素限值的確定

細菌內毒素限值 ( L) = K/M,式中 K 為人每千克體重每小時最大可接受 的內毒素劑量,單位為 EU/( kg·h) ; M 為人每千克體重 每小時的最大供試品劑量,單位為 mg /( kg·h) 。《中華 人民共和國藥典》( 2015 年版) 中規定,注射劑 K = 5 EU/( kg·h) ; 3 種蛋白每次最大注射劑量為 0. 12 mg, 人均 體 重 按 60 kg 計 算,注 射 時 間 為 1 min,M = 0. 12 mg /60 kg× 1/60 h = 0. 12 mg /( kg·h) ,則 L = 5 [EU/( kg·h) ]/0. 12 [mg /( kg·h) ]= 41. 67 EU/mg。

3 結果與分析

采用間接 ELISA 法檢測 3 種蛋白免疫組和對照 組小鼠血清抗體水平,結果 3 種蛋白免疫后小鼠血清 抗體效價均隨免疫進程持續升高,免疫組與對照組差 異顯著( P<0. 05) ,見表 1。


4 結論

銅綠假單胞菌內毒素蛋白免疫原性很好,但內毒 素含量略高,以其作為疫苗的主要成分會有一定的不 良反應; 外毒素 A 經甲醛脫毒而成的類毒素和外膜 蛋白的免疫原性也較好,且內毒素含量較低,因此本研究測定了內毒素蛋白、類毒素和外膜蛋白的免疫原 性和內毒素含量,制備了 5 組混合蛋白疫苗。研究表 明: 3 號混合蛋白疫苗的免疫效果與內毒素蛋白持 平,估計是 3 種抗原組分聯合免疫后對機體的免疫系 統產生了協同效應,而且 3 號混合蛋白疫苗內毒素含量低于內毒素蛋白,有希望成為一種免疫效果好、不 良反應少的銅綠假單胞菌疫苗。

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