知母為百合科植物知母 ( Anemarrhena asphodeloides Bge.) 的干燥根莖,具有清熱瀉火、滋陰 潤燥的功效。知母皂苷是知母的主要有效成分, 含量 約 為 6%,包括呋甾皂苷如知母皂苷 B Ⅱ ( timosaponin BⅡ,TBⅡ) 、螺甾皂苷如知母皂苷 AⅢ ( timosaponin AⅢ,TAⅢ) 和知母皂苷元( sarsasapogenin, SAR) 等。
1 實驗材料
1.1 菌株
ATCC 標 準 株: 白 念 珠 菌 ( Candida albicans) SC5314 和 Y0109、新型隱球菌( Cryptococcus neoformans) ATCC32609,由上海長征醫院菌種保存 中 心 贈 送。臨 床 株: 紅 色 毛 癬 菌 ( Trichophytonrubrum) 、石膏樣小孢子菌( Microsporum gypseum) 、 須癬毛癬菌( Trichophyton mentagrophytes) ,均由上海 長海醫院真菌室提供,采自該院不同科室的臨床樣 本,并經形態學和生化學鑒定。
1.2 藥物及試劑
知母飲片,上海康橋藥業有限公 司( 批號: 170305) ; TBⅡ和 TAⅢ對照品,純度>98%,上海源葉生物科技有限公司; β-葡萄糖苷酶,上海寶 豐生化有限公司; 氟康唑注射液,輝瑞制藥有限公司 ( 批號: B297805) ; 甲醇( 色譜純) 、乙腈( 色譜純) 、無 水乙醇( 分析純) ,國藥集團化學試劑有限公司。
1.3 主要儀器
高效液相色譜儀( Agilent 1100) 及 液相色譜系統( Agilent 1290,包括 G4220A 型二元輸 液泵、G4226A 型自動進樣器、G1316C 型柱溫箱) , 美國 Agilent 公 司; 蒸發光散射檢測器 ( Alltech 3300) ,美 國 Grace 公 司; 酶 標 分 析 儀 ( Multiskan MK3) ,芬蘭 Labsystems Dragon 公司; 超聲波清洗器 ( KH-400KDB) ,鞏義市予華儀器有限公司; 電子分 析天平( XS105) ,瑞士 Mettler Toledo 公司; 電熱恒溫 水浴鍋( XMTD-8222) 、真空干燥箱( DZF-6050) ,上海精宏實驗設備有限公司; 臺式恒溫振蕩器( THZ82A) 、隔水式電熱恒溫培養箱( PYX-DHS-400-BS- Ⅱ) ,上海躍進醫療器械廠; 循環水式多用真空泵 ( SHB-ⅢA) ,鄭州長城科工貿有限公司; 旋轉蒸發 儀( RE-52AA) ,上海申生科技有限公司。
2 方法與結果
2.1 知母乙醇提取物制備
稱取知母飲片 60 g,加 入 6 倍量 50%乙醇,加熱回流提取 2 h,共 2 次。過 濾后合并提取液,減壓旋轉蒸發,回收乙醇,水浴蒸 干后轉移至真空干燥箱,于 60 ℃ 減壓干燥過夜,制 得知母乙醇提取物。
2.2 知母乙醇提取物酶水解物制備
稱取知母乙 醇提取物和 β-葡萄糖苷酶各 4 g,置于帶塞錐形瓶 內,加入 200 ml 醋酸-醋酸鈉緩沖液,放入恒溫振蕩 器,50 ℃條件下振搖 2 h。采用等體積的水飽和正 丁醇萃取提取物 3 次,氨試液洗滌 3 次,合并正丁醇 萃取液,減壓旋轉蒸發,回收正丁醇,置于真空干燥 箱,60 ℃減壓干燥,制得知母乙醇提取物酶水解物。
2.3 抗真菌作用比較
2.3.1 抑菌圈實驗
吸取 5 μl 白念珠菌 SC5314 菌 液( 濃度為 1×104 CFU/ml) ,用無菌涂布棒均勻涂布 在培養基表面,每個培養基平板上間隔 20 mm 輕放 2 個無菌牛津杯,每個牛津杯中注入 150 μll 供試品藥液( 知母乙醇提取物及其酶水解物) 。將培養基 平板置于生化培養箱內,于 30 ℃ 下培養 48 h,測量 抑菌圈直徑。 結果顯示,知母乙醇提取物在 320 mg /ml 時對 白念珠菌 SC5314 有一定的抑制作用,抑菌圈直徑 為 6 mm; 其酶水解物在 27 mg /ml 和 13.5 mg /ml 時 對白念珠菌 SC5314 具有抑制作用,抑菌圈直徑分 別為 16 mm 和 12 mm,抗真菌效果顯著升高。
2.3.2 最小抑菌濃度( MIC) 測定
采用微量液基稀 釋法檢測知母乙醇提取物及其酶水解物對 5 種常見 致病真菌的 MIC,并以氟康唑為陽性對照藥物。 將白念珠菌 SC5314 和 Y0109、新型隱球菌、紅 色毛癬 菌、須 癬 毛 癬 菌、石膏樣小孢子菌的菌液 100 μl( 濃度為 1 × 104 CFU/ml) 分別接種于 96 孔 板,加入不同濃度的受試藥物或陽性對照藥物,藥 液終濃度分別為 64、32、16、8、4、2、1、0.5 mg /L,陰性 對照孔不添加任何藥液干預。白念珠菌于 35 ℃ 靜 置培養 24 h,新型隱球菌于 35 ℃ 靜置培養 72 h,紅 色毛癬菌、須癬毛癬菌、石膏樣小孢子菌于 30 ℃ 培 養 7 d,酶標儀測量各孔在 630 nm 處的 OD 值。與 陰性對照孔相比,以 OD 值下降 80%以上的最低藥 物濃度為 MIC80,即真菌生長 80%被抑制時的藥物 濃度。若 MIC80值高于 64 mg /L,計為“>64 mg /L”。 實驗平行操作 3 次。當 MIC80值能準確重復或只差 一個濃度時可被接受,并以較高濃度作為 MIC80值; 當 MIC80值相差兩個濃度以上時,則需重新實驗,直 至符合要求。采用單因素方差分析對各組 MIC80值 進行 統 計 學 分 析,P<0.05 表示差異具有統計學 意義。 結果顯示,知母乙醇提取物的酶水解物對 5 種 真菌的 MIC80均達 4 mg /L,對石膏樣小孢子菌和須 癬毛癬菌的抑制作用甚至優于氟康唑; 與知母乙醇 提取物 相 比,酶水解物的抗真菌活性顯著增強 ( P<0.01) 。TBⅡ對 5 種真菌的抑制作用均較弱,而 TAⅢ對絲狀皮膚真菌紅色毛癬菌、石膏樣小孢子 菌、須癬毛癬菌的抑制作用較強,MIC80達 4 mg /L。 見表 1。
3 討論
中藥糖苷類成分在體內可代謝轉化為活性更強的次生苷。本研究利用體外生物酶解技術模擬 知母藥材有效成分的體內水解過程,并采用抑菌圈 實驗和微量液基稀釋法考察酶解技術對知母提取 物抗真菌活性的影響。體外研究發現,知母乙醇提 取物對 5 種真菌的抑菌效果均不理想,對白念珠菌、 新型隱球菌、須癬毛癬菌的 MIC80分別為 32 mg /L、 16 mg /L、32 mg /L,對石膏樣小孢子菌和紅色毛癬 菌無明顯抑制作用; 經 β-葡萄糖苷酶作用后,酶水 解物 對 5 種常見致病真菌的 MIC80 均 降 低 至 4 mg /L。此外,酶水解物中的主要成分 TAⅢ( 含量 52.5%) 對須癬毛癬菌、紅色毛癬菌、石膏樣小孢子菌 的 MIC80均為 4 mg /L,而知母乙醇提取物中的主要成 分 TBⅡ對 5 種真菌的抑制活性均較弱。以上結果提 示在 β-葡萄糖苷酶的作用下,TBⅡ轉化為抗真菌活性 更強的 TAⅢ,后者可能是酶水解物發揮抗真菌效應 的主要有效物質之一。臨床上,紅色毛癬菌在皮膚癬 菌中占比最高,可引發甲真菌病和足癬,而須癬毛癬 菌則是頭癬的主要致病菌,本研究結果可能為知母治療皮膚淺表真菌病提供參考和思路。
免責聲明:文章僅供學習和交流,如涉及作品版權問題需要我方刪除,請聯系我們,我們會在第一時間進行處理。