Fas( CD95) ，由日本 Yonehara 實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，作為位于細(xì) 胞表面重要的死亡受體，是凋亡通路中的信號(hào)分子。Fas L( CD178) ，是 fas 的天然配體，fas/fas L 交聯(lián)形成蛋白復(fù)合 體，激活下游多級(jí)酶促反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡，研究發(fā)現(xiàn)自身 免疫性甲狀腺疾病的發(fā)病與凋亡信號(hào)失調(diào)相關(guān)。

1 材料與方法

1． 1 藥物和試劑

平目湯，由黃芪 30 g，淫羊藿 15 g，川芎 15 g，白芥子 15 g，炙鱉甲 15 g，車(chē)前子( 包煎) 30 g 組成，由 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中藥房制備成水煎劑( 生藥 含量為 4 g /mL) ，4 ℃保存。 Trizol  Ｒeagent，Life Technologies Corporation 公 司; DEPC( ＲNA 酶抑制劑) ，Sigma － Aldrich － Life Science 公 司; 無(wú)水乙醇、75% 乙醇、異丙醇、氯仿、十二烷基硫酸鈉 ( SDS) ，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒( GoScripTM Ｒeverse Transcription System) ，Promega 公司; 臺(tái)盼藍(lán) 染液、One cell 細(xì)胞計(jì)數(shù)板，上海魯汶生物科技有限公司; 引物合成，上海閃晶分子生物科技有限公司; Fas 抗體、Fas L 抗體，美國(guó) abcam 公司; GAPDH 單克隆抗體，美國(guó) CST 公 司; 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，美國(guó) Jackson ImmunoＲesearch 公司; 生理鹽水，上海長(zhǎng)征富民金山制藥有限公司; Protein Marker ( PageＲulerTMPlusPrestaind Protein) ，Thermo Fisher Scientific 公司; 蛋白酶抑制劑，Ｒoche Diagnostics 公 司; 微量 BCA 蛋白定量試劑盒，康為世紀(jì)公司; 20% SDS solution、Tris － Hcl Buffer( pH 為 6． 8) 、40% 丙烯酰胺( 40% Acr) 、四甲基二乙胺( TEMED) ，BIO － ＲAD 公司; Tris － Hcl Buffer( pH8． 8) ，北京索萊寶( Solarbio) 科技有限公司; SDS － PAGE 上樣緩沖液( 5 × ) ，碧云天生物技術(shù)研究所; 甘氨 酸( MW75． 07) 、Tween 20，SIGMA － ALDＲICH 公司; 氨基 丁三醇( Tris) ( MW121． 14) ，Sigma 公司; 硝酸纖維素膜 ( PVDF 膜) ，Millipore 公司; 麗春紅染色試劑，康為世紀(jì)公 司; 脫脂奶粉( 國(guó)產(chǎn)伊利牌) ，內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公 司; 顯影劑試劑盒( Immobilon Western 化學(xué)發(fā)光底物) ，Millipore 公司; 胎牛血清，Biowest; DMEM 培養(yǎng)基，上海立菲生 物技術(shù)有限公司( life technologise) 。基因序列通過(guò) GenBank 獲得，由上海閃晶分子生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合 成。引物序列見(jiàn)表 1。

1． 2 儀器

OLYMPUS － ix71 顯微鏡，日本 OLYMPUS 公 司; 低溫冰箱、制冰機(jī)( 型號(hào): SIM － F140) 、高壓蒸汽滅菌 器，日本 SANYO 公司; 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司; SW － CJ 系列潔凈工作臺(tái)，蘇凈安泰公 司; 低溫離心機(jī)、Eppendorf ＲT － PCＲ 系統(tǒng)，Eppendorf 公司;數(shù)顯恒溫水槽( 型號(hào): HH － 2) ，國(guó)華電器有限公司; SL202N 型電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司 ( 批號(hào): 00236) ; BioTek SynergyH4 型酶標(biāo)儀，Bio － Tek 公司; 純水 儀，香港 Heal Force 公司; 垂直電泳儀，BIO － ＲAD 公司; 塑 料薄膜封口機(jī)( 型號(hào): FS － 200) ，永康市特力包裝機(jī)械有限 公司; X85 － 2S 恒溫磁力攪拌器，上海梅穎浦儀器儀表制造 有限公司; 搖床( TS － 8) ，上海精密儀器制造公司; 全自動(dòng)數(shù) 碼凝膠成像系統(tǒng)( G: Box Chemi XT4) ，英國(guó) Syngene 公司。

1． 3 動(dòng)物和平目湯含藥血清的制備

動(dòng)物: SPF 級(jí)雄性 SD 大鼠，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)為: SCXK( 滬) 2012 － 0002。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物部 SPF 級(jí)動(dòng)物房進(jìn)行飼養(yǎng)。

2 結(jié)果

與空 白對(duì)照組比較，平目湯中劑量組對(duì)脂肪細(xì)胞 fas mＲNA 的相 對(duì)表達(dá)量升高( P ＜ 0. 05) ，其余各組則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異( P ＞ 0. 05) 。與空白對(duì)照組比較，平目湯組對(duì)脂肪細(xì)胞 fas LmＲNA 的相對(duì)表達(dá)量均升高( P ＜ 0. 05) ，地塞米松組則無(wú) 統(tǒng)計(jì)學(xué)差異( P ＞ 0. 05) 。平目各湯組間比較: 平目湯高劑 量組與平目湯低劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P ＜ 0. 05) 。見(jiàn)表 2、圖 1。

與空白 對(duì)照組相比，平目湯各組 fas、fas L 蛋白表達(dá)均上調(diào)，差異有 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜ 0. 05) ，地塞米松組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異( P ＞ 0. 05) 。在升高 fas 表達(dá)方面，平目湯高劑量組與平目湯中 劑量組、平目湯低劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜ 0. 05) 。平目湯中劑量組與平目湯低劑量組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué) 差異( P ＞ 0. 05) 。

3 討論

Fas/fas L 通路，即死亡受體通路，死亡受體的活化 是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要途徑之一。fas，相對(duì)分子量為 45 kDa，是腫瘤壞死因子/神經(jīng)生長(zhǎng)因子( TNF/NGF) 受體超家 族成員之一，由 325 個(gè)氨基酸組成的受體分子，為Ⅰ型跨膜 糖蛋白，胞內(nèi)段帶有特殊的死亡結(jié)構(gòu)域( DD) ，是一種調(diào)節(jié) 細(xì)胞凋亡的膜蛋白。fas L，分子量約為 40kDa，為Ⅱ型跨膜 糖蛋白，同屬于腫瘤壞死因子( TNF) 超家族，為 Fas 的天然配體，兩者結(jié)合可以啟動(dòng)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起細(xì)胞死 亡。fas L 是同源三聚體，1 個(gè) fas L 分子可以結(jié)合 3 個(gè) fas 分子，三聚化的 fas 分子的 DD 相聚成簇，與帶有相同死 亡結(jié)構(gòu)域的連接蛋白 FADD 的 DD( C 端) 結(jié)合，形成 fas － FADD 復(fù)合體，再由 FADD 的 N 端傳遞死亡信號(hào)，引發(fā)級(jí)聯(lián) 反應(yīng)，致細(xì)胞凋亡。Graves 病的甲狀腺細(xì)胞存在凋亡 現(xiàn)象，研究人員在 Graves 患者甲狀腺組織、甲狀腺細(xì) 胞中發(fā)現(xiàn) fas、fas L 呈高表達(dá)。Hara 等研究發(fā)現(xiàn) GD 患者甲狀腺功能亢進(jìn)時(shí)，sFas 表達(dá)水平升高，當(dāng)甲狀腺 功能恢復(fù)正常時(shí)，sFas 的表達(dá)水平則降低。Koga M 等 選取甲狀腺相關(guān)性眼病患者的眼外肌組織，發(fā)現(xiàn)眼外肌纖 維及間質(zhì)細(xì)胞均存在細(xì)胞凋亡，且凋亡程度與眼外肌的增 粗程度呈正相關(guān)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)眼外肌纖維中 fas 顯著表達(dá)。 通過(guò)文獻(xiàn)回顧，我們推測(cè) fas/fas L 可能是一個(gè)有效防治 GO 的潛在性靶點(diǎn)。