他 克 莫 司（tacrolimus）為 17- 烯丙基 -1，14- 二羥基 -12-［2-（4- 羥 -3- 甲氧基環(huán)己基）-1- 甲 基乙烯基］-23，25- 二甲氧基 -13，19，21，27- 四甲 基 -11，28- 二 噁 -4- 氮 雜 環(huán)［22.3.1.04，9］二 十 八 烷 -18- 烯 -2，3，10，16- 四 酮 一 水 合 物，結(jié) 構(gòu) 式 見 圖 1。相對分子質(zhì)量 822.02，按 無 水 物 計 算，含 C44H69NO12（他克莫司與異構(gòu)體I、異構(gòu)體II之和）應(yīng)為 98.0％ ~102.0%。

1　實驗材料

1.1 樣品　

他克莫司原料，國藥川抗有限公司生產(chǎn)， 批號 160501、160502、160503。

驗證實驗所用的菌株傳代次數(shù) 不得超過 5 代，并采用適宜的菌種傳代、保藏技術(shù)， 以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。大腸埃希菌 CMCC （B）44102（第 三 代）、金 黃 色 葡 萄 球 菌 CMCC（B） 26003（第三代）、枯草芽孢桿菌 CMCC（B）63501（第 三代）、銅綠假單胞菌 CMCC（B）10104（第三代）、黑 曲霉 CMCC（F）98003（第三代）、白色念珠菌 CMCC （F）98001（第三代），均由四川省食品藥品檢測檢驗 院提供。

含 0.1% 吐溫 80（成都市科 隆化學(xué)品有限公司，AR，500 mL·瓶 -1）的 pH 7.0 無 菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液（北京三藥科技開發(fā)公司， 250 g·瓶 -1），無菌十四烷酸異丙酯（北京牛?；蚣?術(shù)有限公司，200 mL·瓶 -1），胰酪瓊大豆胨脂培養(yǎng)基 （北京三藥科技開發(fā)公司，250 g·瓶 -1），胰酪瓊大豆胨 液體培養(yǎng)基（北京三藥科技開發(fā)公司，250 g·瓶 -1）， 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（北京三藥科技開發(fā)公司， 250 g·瓶 -1），麥康凱液體培養(yǎng)基（北京三藥科技開 發(fā)公司，250 g·瓶 -1），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（北京三藥 科技開發(fā)公司，250 g·瓶 -1）。

SW-CJ-2FD 潔凈工作臺（蘇州安 泰空氣技術(shù)有限公司），ESCO-AC2-6S1 生物安全柜 （新加坡藝思高有限公司），LDZH-100KBS 壓力蒸汽 滅菌器（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），LY05-300 恒 溫恒濕培養(yǎng)箱（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司，LY05- 300，MJP-150 霉菌培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限 公司），HTY-2000 集菌儀（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備 有限公司）等。

接種銅綠假單胞菌、金黃色葡 萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌置 10 mL 胰酪大 豆胨液體培養(yǎng)基中，33 ℃培養(yǎng) 18~24 h。取上述新鮮培養(yǎng)液 1 mL，加 0.9% 無菌氯化鈉溶液 9 mL，采用 10 倍遞增稀釋法，稀釋至 10-5~10-8，制成含菌數(shù)約小于 100 cfu·mL-1 的菌懸液。

接種白色念珠菌至 10 mL 沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng) 24~48 h。取此 新鮮培養(yǎng)液 1 mL，加 0.9% 無菌氯化鈉溶液 9 mL，采 用 10 倍遞增稀釋法，稀釋至 10-5~10-7，制成含菌數(shù)約 為小于 100 cfu·mL-1 的菌懸液。 2.1.3　黑曲霉菌菌液　接種黑曲霉菌至沙氏葡萄 糖瓊脂斜面培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng) 5~7 d，在新鮮培 養(yǎng)物中加入 3~5 mL 含 0.05% 聚山梨酯 80 的 0.9% 無 菌 氯 化 鈉 溶 液，將 孢 子 洗 脫，取 1 mL 吸至無菌 試 管 內(nèi)，加 含 0.05% 聚山梨酯 80 的 0.9% 無菌氯 化鈉溶液 9 mL，采 用 10 倍 遞 增 稀 釋 法，稀 釋 至 10-5~10-7，制成含菌數(shù)約小于 100 cfu·mL-1 的菌懸 液。

按上述方法，進行 3 次獨立平行試驗，并分別計 算各試驗菌每次試驗的回收試驗比值。

回收試驗比值=（試驗組平均菌落數(shù) - 供試品 對照組平均菌落數(shù)）/ 菌液對照組組平均菌落數(shù)

取 1∶10 的供試液② 10 mL，加 入 100 mL 含 0.1% 吐 溫 80 的 pH 7.0 無菌氯化鈉 - 蛋 白胨緩沖液，混勻，過濾，用 900 mL 含 0.1% 吐溫 80 的 pH 7.0 無菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液分次沖洗，每 次不超過 100 mL，在最后 1 次沖洗液中加入大腸埃 希菌菌懸液 1 mL（小于 100 cfu），取濾膜至 300 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，置 33 ℃培養(yǎng) 18~ 24 h。

本次對他克莫司微生物限度方法學(xué)驗證過程中 發(fā)現(xiàn)，他克莫司原料對霉菌的抑菌作用最強，須將供 試品進行 1∶100 濃度稀釋、萃取，并按最大沖洗量 對濾膜進行沖洗（《中華人民共和國藥典》要求每張 濾膜每次沖洗量一般為 100 mL，總沖洗量不得超過 1 000 mL ）并使用了吐溫 80 作為乳化劑；而對 需氧菌抑菌性作用沒有對霉菌抑菌性作用強，實驗過 程中發(fā)現(xiàn)按 1∶10 濃度稀釋并沖洗 1 000 mL 沖洗液 能達到消除抑菌性的效果，但根據(jù)藥典要求都采取了 相同的供試液制備方法及沖洗用量進行計數(shù)方法適 用性試驗。驗證過程中采用了單一的平皿法或培養(yǎng) 基稀釋法進行適用性試驗，也采用單一的薄膜過濾法 用不同的沖洗量進行適用性試驗，未能達到回收比值 要求，只將最后試驗成功的方法聯(lián)用進行了體現(xiàn)。



 

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