本試驗(yàn)的目的是為了確認(rèn)所采用的中國藥典 2015 年版四部和 2015 年版第一增補(bǔ)本四部 中的微生物限度檢查方法適用于大豆磷酯需氧菌進(jìn)行適用性試驗(yàn)，滿足藥典規(guī)定的檢驗(yàn)要求。

隔水式恒溫培養(yǎng)箱；生化培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；立式壓力蒸汽滅菌器；鼓風(fēng)干燥箱；生物安全柜；電 冰箱。

金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，枯草芽孢桿菌，白色念珠菌，黑曲霉，大腸埃希菌。 菌種來源均為中國食品藥品檢定研究院，菌種代數(shù)依次為第三代，第三代，第五代，第三代， 第三代，第三代。

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基；麥康凱肉 湯培養(yǎng)基，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

器具 錐形瓶；無菌刻度吸管；無菌培養(yǎng)皿；無菌試管；剪刀；接種環(huán)；酒精燈。

取金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，枯草芽孢桿菌，白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物適量，用 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液分別制成含菌數(shù)約為 103～104 cfu/ml 的菌懸液備用。 取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物，加入 5ml 含 0.05%（ml/ml）吐溫 80 的 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白 胨緩沖液，將孢子洗脫，洗脫液經(jīng)滅菌的脫脂棉過濾后，用膠頭滴管吸入至經(jīng)滅菌的試管內(nèi)， 用含 0.05%（ml/ml）吐溫 80 的 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成含菌數(shù)約為 103～ 104 cfu/ml 的菌懸液備用，24 小時(shí)內(nèi)使用。 取大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物適量，用 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成含菌數(shù)約為103～104 cfu/ml 的菌懸液備用。

取供試品 10g，加 pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至 100ml，使供試品分散均勻，制成 1：10 供試液。

取上述制備好的 1：10 供試液 9.9ml 5 支，分別加入金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌， 枯草芽孢桿菌，白色念珠菌和黑曲霉 0.1ml（含菌量約為 103～104 cfu/ml），混勻。分別取 1ml 注入無菌平皿中，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，混勻，倒置培養(yǎng)。按平皿傾注法測定其菌落 數(shù)，同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。

適用性試驗(yàn)（平皿法） 取上述制備好的 1：10 供試液 9.9ml 2 支，分別加入白色念珠菌和黑曲霉 0.1ml（含菌 量約為 103～104 cfu/ml），混勻。分別取 1ml 注入無菌平皿中，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基， 混勻，倒置培養(yǎng)。按平皿傾注法測定其菌落數(shù)，同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。

試驗(yàn)組：分別按上述菌落計(jì)數(shù)方法進(jìn)行試驗(yàn)組菌落的計(jì)數(shù)。 菌液對照組：以稀釋液代替供試品溶液，按照試驗(yàn)組的菌落計(jì)數(shù)方法試驗(yàn)。 供試品對照組：按菌落計(jì)數(shù)方法，不加試驗(yàn)菌，測定供試品本底菌落數(shù)。 陰性對照試驗(yàn)：用刻度吸管吸取稀釋液 1ml 置直徑 90mm 的無菌平皿中,注入 15～20ml 熔化的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，倒置培養(yǎng)。陰性對照試驗(yàn)應(yīng) 無菌生長。如果陰性對照有菌生長，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。 培養(yǎng)條件：需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)時(shí)，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，枯草 芽孢桿菌培養(yǎng)溫度為30～35℃，培養(yǎng)時(shí)間3～5天；白色念珠菌和黑曲霉培養(yǎng)溫度為30～35℃， 培養(yǎng)時(shí)間 5 天。霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)時(shí)，白色念珠菌和黑曲霉培養(yǎng)溫度為 20～25℃，培養(yǎng)時(shí)間 5 天。結(jié)果見表 1，表 2。 結(jié)果判斷：

回收率：應(yīng)在 0.5～2 范圍內(nèi)。

適用性試驗(yàn) 試驗(yàn)組：取 1:10 供試液 10ml，接種到 100ml 胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，加入大腸埃 希菌 1ml，（含菌量為 10～102 cfu/ml），混勻， 30～35℃培養(yǎng) 18 小時(shí)，應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。 陽性對照試驗(yàn)：取稀釋劑 10ml，接種至 100ml 胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，加入大腸埃 希菌 1ml，（含菌量為 10～102 cfu/ml），混勻， 30～35℃培養(yǎng) 18 小時(shí)，應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。 陰性對照試驗(yàn)：取稀釋液 10ml 接種至 100ml 胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，混勻， 30～ 35℃培養(yǎng) 18 小時(shí)，陰性對照試驗(yàn)應(yīng)無菌生長。如果陰性對照有菌生長，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。 選擇和分離培養(yǎng)：分別取上述培養(yǎng)物 1ml 接種至 100ml 麥康凱肉湯培養(yǎng)基中，42～44℃ 培養(yǎng) 24 小時(shí)。 取麥康凱肉湯培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上, 30～35℃培養(yǎng) 18 小時(shí)。 上述試驗(yàn)組若檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查方法進(jìn)行供試品檢查；若未 檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)消除供試品的抑菌活性并重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。

適用性試驗(yàn)，霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)和控制 菌檢查方法適用性試驗(yàn)，分別要進(jìn)行三次試驗(yàn)。結(jié)果見表 3。

3 結(jié)論

由以上對大豆磷酯需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)和控制菌方法適用性試驗(yàn)可以看 出，按平皿法（1：10）對金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，枯草芽孢桿菌，白色念珠菌和黑 曲霉總數(shù)測定的回收率在 0.5～2 范圍內(nèi)，確定此法適用于本品需氧菌總數(shù)測定。按平皿法（1： 10）對白色念珠菌和黑曲霉總數(shù)測定的回收率在 0.5～2 范圍內(nèi)，確定此法適用于本品霉菌和 酵母菌總數(shù)測定。按常規(guī)法進(jìn)行大腸埃希菌檢驗(yàn)，試驗(yàn)組和陽性對照組菌生長良好，陰性對 照均無菌生長，確定此法適用于本品大腸埃希菌檢驗(yàn)。