春雷霉素(Kasugamycin)又名春日霉素?加收米?加瑞農等,是由春日鏈霉菌(Streptomyceska-sugaensis)所產生的一種氨基糖苷類抗生素.春雷霉素作為農用殺菌劑,被廣泛應用于農業生產,不僅具有較好的防治植物疾病的效果,并且對人畜無毒害作用,無污染和無殘留符合現代環保要求,是目前最具推廣前景的綠色農藥之一,也是當前農作物病蟲害防治中具有廣闊發展前景的農藥之一.春雷霉素的結構由春雷胺(Kasugamine)?D-肌醇(D-inositol)和二碳側鏈(Two-carbonsidechain)共三部分組成,如圖1所示。

傳統育種中,春雷霉素產生菌通常采用紫外線照射法進行誘變育種.Genomeshuffling技術是利用基因洗牌技術在全基因組水平上的拓展,采用遞歸原生質體融合的方法來模擬基因組洗牌技術中的PCR熱循環.可以對不同突變表型的若干個菌株的全基因組進行隨機的重組,從而選育出具有良好生產性能?遺傳特征具有較大改進的雜交菌株的方法.例如,Zhang等利用基因組洗牌育種的方法提高弗氏鏈霉菌的泰樂菌素的產量;龔國利等通過基因組洗牌技術選育埃博霉素B高產菌株,使得纖維堆囊菌的埃博霉素B產量提高了35.1倍.本文以從不同發酵罐批分離篩選到5株遺傳多樣性的春雷霉素生產菌株作為出發菌株,通過基因組洗牌技術選育出高產春雷霉素的重組菌株。

從不同發酵罐批分離篩選到5株春雷霉素產 生菌S17-128,S17-261,S18-050,S18-051,S18- 081,其春雷霉素的產量分 別 為 14007,14738, 14520,14551和14048 mg/L,這5個 菌株 作 為 Genomeshuffling 育 種 的 出 發 菌 株,工 業 生 產 菌 KB2010S17-182由 陜西 麥 可 羅 生 物 科 技 有 限 公 司提供.菌株培養在小金色鏈霉菌固體平板上,菌 體細胞懸浮在40%甘油溶液中低溫冰箱保存.指示菌:灰梨孢菌 DLB2015由陜西麥可羅生物科技有限公司提供。

(1)斜面培養基及分離培養基:葡 萄 糖(AR) 1.0%?蛋白胨(BR)0.3%?黃豆餅粉(IR)1.0%? NaCl(AR)0.5%?CaCO3(AR)0.3%?瓊脂2%, 蒸餾水配制,消前pH7.2~7.4。

(2)搖瓶種子培養基:玉米油2%?豆餅粉5%? 卵磷脂0.2%?磷酸氫二鉀0.5%?硫酸鎂0.05%? 氯化鈉0.2%,pH 自然。

(3)搖瓶發酵培養基:玉 米 油 2%?卵 磷 脂 0.5%?豆 餅 粉 5%?磷 酸 氫 二 鉀 0.2%?硫 酸 鎂 0.1%?氯化鈉0.3%,pH 自然。

(4)種子罐培養基:玉米油2%?豆餅粉5%?卵 磷脂0.2%?磷酸氫二鉀0.3%?硫酸鎂0.05%?氯 化鈉0.2%,pH 自然。

(5)發酵罐培養基:豆油2%?豆餅粉6%?卵磷 脂0.5%?硫酸銨0.01%?磷酸氫二鈉0.1%?磷酸 二氫鉀0.3%?硫 酸鎂0.01%?氯 化鈉0.2%,pH 自然。

(1)TPM 液:0.001mol/LK2HPO4-KH2PO4, 0.008mol/L硫酸鎂,0.01mol/LTris-HCl,pH7.6, 滅菌備用。

(2)Tris緩 沖液:0.067 mol/L,pH8.0,滅 菌 備用。

(3)EDTA 溶液:稱取5gEDTA 于90mL水 中溶解,調節pH 至8.0,然后定容至100mL,滅菌 備用。

(4)MMM緩沖液:0.02mol/L馬來酸,0.3mol/L 甘露醇,0.02mol/L氯化鎂,pH6.5,滅菌備用。

Lyticase(10U/μL)溶菌酶,購自上海翊圣生物科技有限公司。

(1)搖瓶培養條件:培養液30mL/300mL 廣 口三角瓶,培養 溫 度28 ℃;轉 速220rpm;培 養周 期30~36h。

(2)種子罐培 養 條 件:培 養 溫 度28 ℃;通 氣量 1∶1VVM;攪拌轉速300rpm;培養周期24~28h; 接種量1%。

(3)發酵罐培養條件:培養溫度28℃;通氣量1∶ 0.7VVM;攪拌轉速150rpm;發酵周期192~210h; 接種量10%。

MQD-0.4型壓力蒸汽滅菌器(邢臺醫療器械 廠),OLYMPUSCX31RTSF 顯 微鏡(日本Olym- pus公司),YT-CZ-ZN 超凈工作臺(北京亞泰科隆 有限公司),MBR-304DR血液保存箱(深圳市凱銘 杰儀器設備有限公司),HY-5回旋多用振蕩器(金 壇市華峰 儀 器 有 限 公 司),HW·SY21-KP4 電子恒溫水浴鍋(北京市長風儀表儀器廠),LC-10Avp 液相色譜儀(島津儀器(蘇州)有限公司),SHP-080生化培養箱(上海精宏實驗設備有限公司, 無菌96孔板(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)。

無菌操作取 不 同 發 酵 罐 批 發 酵190h的 發酵 液,在無菌室超凈工作臺內將無污染的發酵液劃線 在分離培養基上,28 ℃恒 溫恒 濕 培 養9~11d后 取出平板,在無菌室超凈工作臺內挑取草帽型灰色 菌落,轉接后進行劃線分離,直至挑取到單個菌落, 其孢子生長豐滿,呈灰白色至粉灰色,基內菌絲及 分泌的可溶性色素為淡黃色.然后挑取單菌落作為 種子菌進行液體培養2~3d,離心收集菌體。

收集 出 發 菌 株,調 整 其 濃 度 為 1×106 cell/ mL,MMM 緩沖液懸浮,加入10U/μL 的溶壁酶 液,28 ℃,30 min進 行酶 解,離 心 收 集 原 生 質 體, MMM 緩沖液重懸離心后繼續用 MMM 緩沖液懸 浮備用.取酶解完全的原生質體懸液0.5mL,適量 MMM 緩沖液稀釋后于斜面培養基,28 ℃培 養直 至觀察到單菌落。

本研究采用滅活原生質體融合,提高了基因組 洗牌育種的效率. 紫外線滅活:在無菌室超凈工作臺內,把 懸 浮 的原生質體轉到 Φ9cm 的無菌平皿內,于30W 的 紫外燈下,分別照射20s?40s?60s?80s和100s進行紫外滅活,經再生培養檢查滅活效果. 加熱滅活:把懸浮的原生質體轉到無菌試管中 分別置于不同溫度水浴(40?50和60 ℃),熱滅火 處理1min?3min?5min和7min,然后利用再生 培養檢查其滅活的效果. 取1mL 濃度為1×108cell/mL 不 同滅 活 的 出發 菌 株 懸 液 混 合,離 心 收 集,棄 上 清 液 后 用 MMM 緩沖液懸浮.隨后加入2mL40%的 PEG- MMM,28 ℃ 15min.離心 MMM 洗滌,MMM 重 懸,利用雙層培養法再生,28 ℃培養9~11d.融合 率通過融合子和滅活親本的再生情況進行計算. 首先選 取 的 PEG 濃 度為 10%?20%?30% 和 40%,反應時 間 為10 min,得 到最 佳 濃 度 后,設 置 5min?10min?15和20min不同對反應時間進行 實驗. 融合率a=[(b-c)/d]×100%,式 中a 為原 生質體融合率;b為融合再生的菌落數目;c為滅活 親本再生的菌落數目;d為親本再生的菌落數目。

將滅活后的原生質體在合適條件下進行隨機 融合,通過雙層平板培養法再生后,平板上的再生 菌落為 F1代的融合菌群;然后將其作為出發菌 株,滅活后再融合,再生,反復重復5輪融合再生后 得到 F2代 融 合 菌 群,然 后 反 復5輪 融 合 再 生.獲 得的最終菌群對其篩選和檢測,從而獲得到高產春 雷霉素菌株 .其中對照組為加入的溶菌酶用無 菌水代替,其他實驗步驟一致。

本實驗通過高通量篩選法進行篩選,首 先 在 96孔板中的孔 中 加 入200μL 滅菌的 固 體 發 酵 培 養基,平行接種誘變菌株于兩塊96孔板(a板和 b 板).然后再a板的孔加入適量的灰梨孢菌,28 ℃ 培養9~11d,然后用微板光譜儀進行檢測,選取透 光度較大的菌株作為 目 標 菌 株.b板 于20 ℃下 培 養4d后,保藏于4 ℃冰箱待用.等a板培養結束 后,從b板上取出相應的菌株進行檢測。

將初篩獲得的高產重組子通過液體搖瓶擴大 培養40h,然后按照1∶50的接種量接種于發酵培 養基.發酵體系:300 mL 三角瓶裝 發 酵 培 養 基50 mL,28 ℃,220r/min培養144h.144h發酵液用 草酸調 pH3.0,5000r/min離 心10 min,收 集上 清液待用.然后上清液采用 HPLC(島津高效液相 色譜系統)進行定性和定量測定. 色譜 柱:150×3.9 mm(id)不 銹 鋼 色 譜 柱ODS,粒徑5μm; 流動相:4.0g十二烷基硫酸鈉溶于純水中, 加200mL乙腈,定容至1L,用磷酸調pH2.55,過 濾超聲后備用. 流速:1.0mL/min; 檢測波長:紫外檢測儀,波長為210nm; 柱溫:25~35 ℃; 進樣量:5μL. 本實驗的春雷霉素標準品購買于sigma公司。

獲得的高產春雷霉素菌株進行傳代培養5次 后,進一步利用發酵篩選,篩選得到春雷霉素產量 高并且遺傳穩定性好的重組菌株,然后保藏菌種。

(1)標準溶液配制 稱取標樣0.05g(精確至0.0002g)置 于50 mL容量瓶中,用流動相溶解,稀釋至刻度,搖勻。

(2)試樣溶液的配制稱取 約 含 春 雷 霉 素 0.05g 的 試 樣 (精 確 至 0.0002g)置于50mL 容量瓶中,用流動相溶解, 稀釋至刻度,搖勻,并用0.45μm 濾膜過濾,備用。

(3)測定 在上述條件下,待儀器穩定后,連續注 入 數 針 標準溶液,計算各針響應值的重復性,待相鄰兩針 的響應值變化 小 于1.5%時,按 照標 樣 溶 液?試 樣 溶液?試樣溶液?標樣溶液的順序進行測定。

(4)計算 將測得的兩針試樣溶液以及試樣前后兩針標 樣溶液中春雷霉素的峰面積分別進行平均,試樣中 春雷霉素的質量分數 (%),按式(1)計算:      ω1 =A2 ×m1 ×ω A1 ×m2 ×100% (1)   式(1)中:A1 -標樣溶 液 中,春 雷 霉 素 峰 面 積 平均 值;A2 - 試樣溶 液 中,春雷霉素峰面積平均 值;m1-春雷霉 素 標 樣 的 質 量,g;m2 - 試樣的 質 量,g;ω1-標樣中春雷霉素的質量分數,%。

２ 結果與討論

將不同批次的發酵罐中篩選到的具有遺傳多 樣性的菌株作為出發菌株,利用小金色鏈霉菌(S. microaureus)分離平 板 篩 選 到 了 到5株 遺 傳 差 異 大的菌株,分別為 S17-128,S17-261,S18-050,S 18-051,S18-081,這5株菌株作為 Genomeshuff- ling的出發菌株.產量最高的菌株S17-261的春雷 霉素產量為14738mg/L,見圖2所示。

基因組shuffling過程中的關鍵步驟在于原生 質體制備與再生,本實驗中首先確定了制備和再生的培養基的種類?方法和滲透壓穩定劑.另外酶解 的溫度?時間和酶解前預處理的因素見表1所示. 結果表明,在制備原生質體時,EDTA 預處理細胞 可以提高細胞壁酶解的效率.通過實驗結果,本文 最終選擇的滲透壓穩定劑為0.3mol/L的甘露醇, EDTA 預處理10min,酶解時間30min,原生質體 再生采用自然擴展法。