百草枯（paraquat，PQ）是目前最為廣泛的應(yīng) 用除草劑之一。PQ 對(duì)人畜具有非常強(qiáng)的毒性，PQ 急性中毒死亡率高達(dá) 50%~80%。PQ 常用于自殺、 投毒，是臨床和司法檢驗(yàn)中較常見的毒物。百草枯 中毒機(jī)制十分復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)，除了百草枯本身的 理化作用外，還有大量炎性因子和細(xì)胞因子參與作 用。目前 PQ 中毒機(jī)制的主流因素為氧化損傷，即活性氧簇（ROS）可直接損傷肺、腎、肝等器官。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑 

氣相色譜 7890B（美國(guó)安捷倫公司）、質(zhì)譜儀 PEGASUS HT（美國(guó) LECO 公司）、離心機(jī) Heraeus Fresco 17（美國(guó)賽默飛科技公司）、超低溫冰箱 Forma 900 series（美國(guó)賽默飛科技公司）、超聲儀（寧 波新芝科技有限公司）、烘箱、真空干燥儀（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司）。甲醇（色譜純，CNW 科技公司）、 吡啶（色譜純，Adamas 試劑公司）、甲氧銨鹽（分 析純，TCI 試劑公司），L-2- 氯苯丙氨酸（≥ 98%， 上海恒柏生物科技）、BSTFA（with 1%TMCS,v/v） （Regis 科技公司）。 

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 

動(dòng)物為昆明小鼠（沈陽長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司 提供）10 只雌鼠，8 周齡，自由飲水、進(jìn)食，適應(yīng) 性喂養(yǎng) 1 周。隨機(jī)分為空白對(duì)照組和百草枯中毒模 型組共 2 組，每組 5 只小鼠。取 5 只小鼠，灌胃百 草枯劑量為 30 mg/kg?？瞻讓?duì)照組腹腔注射同等劑 量的生理鹽水溶液。24h 后處死動(dòng)物，取心血 0.3 mL，4℃下 15000 r/min 離心 10 min，取上清置于 1.5mLPE 管，置于 -80℃冰箱凍存。 

1.3 GC-MS 樣品預(yù)處理

取50μL樣本于1.5mL EP管中，加入200μL甲醇， 再加入 5μL L-2- 氯苯丙氨酸（溶于超純水中 0.5mg/ mL），渦旋 30s 混勻；將樣本 4℃離心，12000rpm 離心 15min；小心移取 200μL 上清液于 1.5mL EP 管 中；在真空濃縮器中干燥提取物；向干燥后的代謝物 加入 30μL 甲氧胺鹽試劑（甲氧胺鹽酸鹽，溶于吡啶 20mg/mL），輕輕混勻后，放入烘箱中 80℃孵育 30min；向每個(gè)樣品中加入 40μL BSTFA（含有 1% TMCS, v/v），將混合物 70℃孵育 1.5h，上機(jī)檢測(cè)。 

1.4 儀器條件 

Agilent7890 GC-TOF-MS，色譜柱 DB-5MS（30 m×250μm×0.25μm），程序升溫：初始溫度 50℃保 持 1min，以 20℃ /min 的升溫速率升至 310℃，保 持 6min。進(jìn)樣口溫度 280℃，傳輸線溫度 280℃， 離子源溫度 250℃，電離電壓 70 ev，質(zhì)量范圍 m/z 50-500 amu，氦氣流速為 1ml/min，分流比（1:20） 進(jìn)樣。 

1.5 數(shù)據(jù)處理 

使 用 ChromaTOF 軟 件（V 4.3x，LECO） 對(duì) 質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了峰提取、基線矯正、解卷積、峰 積分、峰對(duì)齊等分析。對(duì)物質(zhì)定性工作中，使 用了 LECO-Fiehn Rtx5 數(shù)據(jù)庫，包括質(zhì)譜匹配及 保留時(shí)間指數(shù)匹配。采用主成分分析（principle component analysis, PCA）觀察各組樣本之間的 整體分布狀況。采用多維分析方法正交偏最小 二乘法判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）方法用來評(píng)價(jià) 模型的準(zhǔn)確性，選取變量重要性投影（the variable importance in the projection，VIP）值＞ 1 的差異 代謝物。本研究同時(shí)采用學(xué)生 t 檢驗(yàn)，選定 P ＜ 0.05 為有顯著性差異。

2 結(jié)果 

2.1 血清代謝組學(xué)分析 

PQ 中毒模型組與對(duì)照組的血液樣本經(jīng)過硅烷化 衍生、GC-MS 檢測(cè)，得到 GC-MS 總離子流色譜圖， 本次實(shí)驗(yàn)共檢出 591 個(gè)峰。為得到明確的代謝物的差異信息，需要 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)進(jìn)一步處理數(shù)據(jù)。 通過對(duì)對(duì)照組、PQ 中毒組小鼠血清中代謝物 質(zhì)進(jìn)行 PCA 分析，發(fā)現(xiàn)：PQ 中毒組 與對(duì)照組無交叉重疊，具有明顯的分離趨勢(shì)，說 明這兩組間小鼠血清代謝物發(fā)生了明顯的變化。 圖 2b 中橫坐標(biāo) tP 表示第一主成分的預(yù)測(cè)主成 分得分，縱坐標(biāo) tO 表示正交主成分得分，散 點(diǎn)形狀和顏色表示不同的實(shí)驗(yàn)分組。從 OPLSDA 得分圖的結(jié)果可以看出，兩組樣本區(qū)分非常 顯著，樣本全部處于 95% 置信區(qū)間（Hotelling’s T-squaredellipse）內(nèi)。

2.2 潛在生物標(biāo)志物的確定 

本次實(shí)驗(yàn)檢出了 591 個(gè)峰，采用 OPLS-DA 模 型第一主成分的 VIP（Variable Importance in the Projection）值（閾值＞ 1），并結(jié)合學(xué)生 t 檢驗(yàn)（t-test） 的 p 值（閾值≤ 0.05）來尋找差異性表達(dá)代謝物。 本研究將篩選差異代謝物的結(jié)果以火山圖（volcano plot）的形式進(jìn)行可視化，PQ 中毒模型對(duì)對(duì)照組的 結(jié)果如圖 3 所示，火山圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)代謝物，橫坐標(biāo)代表該組對(duì)比各物質(zhì)的倍數(shù)變化（取以 2 為 底的對(duì)數(shù)），縱坐標(biāo)表示學(xué)生 t 檢驗(yàn)的 P 值（取以 10 為底對(duì)數(shù)的負(fù)數(shù)），散點(diǎn)大小代表 OPLS-DA 模型 的 VIP 值，散點(diǎn)越大 VIP 值越大，散點(diǎn)顏色代表最 終的篩選結(jié)果，顯著上調(diào)的代謝物以紅色表示，顯 著下調(diào)的代謝物以藍(lán)色表示，非差異性的代謝物為 灰色。

3 討論 

百草枯中毒后會(huì)累及多器官損傷，靶器官是肺 臟，經(jīng)肺臟攝取百草枯后發(fā)生氧化還原反應(yīng)，會(huì)干 擾線粒體電子傳遞，產(chǎn)生大量氧自由基，誘發(fā)脂質(zhì)過氧化損傷，導(dǎo)致線粒體功能障礙。線粒體是細(xì)胞 的“發(fā)電廠”，它參與了三羧酸循環(huán)和呼吸鏈的傳遞。本次研究發(fā)現(xiàn)模型組中檸檬酸含量顯著增加， 檸檬酸是三羧酸（TCA）循環(huán)的中間產(chǎn)物，表明 TCA 循環(huán)受阻，底物消耗減少，進(jìn)而會(huì)影響能量供應(yīng)?？傊?，PQ 中毒干擾 TCA 循環(huán)，表現(xiàn)為檸檬酸、 琥珀酸和富馬酸的含量增加。

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